有害藻華（HABs）監(jiān)測/預(yù)警的新解決方案
內(nèi)容提供：澤泉生態(tài)開放實(shí)驗(yàn)室
1 背景
伴隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的同時，生態(tài)環(huán)境持續(xù)惡化。近年來我國水體中有害藻華（Harmful Algal Blooms，HABs）（包括海洋赤潮和淡水水華）持續(xù)高頻次發(fā)生，已嚴(yán)重影響到居民的飲水安全、水產(chǎn)養(yǎng)殖、水體景觀價值等方面，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國各級政府部門和科研機(jī)構(gòu)對水體中浮游植物群落的動態(tài)變化進(jìn)行快速監(jiān)測、對淡水藍(lán)藻水華和海洋硅藻/甲藻赤潮進(jìn)行早期預(yù)警的需求越來越強(qiáng)烈。
目前我國浮游植物和有害藻華的監(jiān)測主要采用顯微計(jì)數(shù)、葉綠素含量測定、衛(wèi)星遙感等技術(shù)。顯微計(jì)數(shù)采集的樣品需要經(jīng)過魯格氏液、甲醛等固定液固定，帶回實(shí)驗(yàn)室沉淀濃縮后進(jìn)行定性定量分析，需要花費(fèi)的時間較長。此外，顯微鏡下藻類分類和計(jì)數(shù)需要非常專業(yè)的人員，且分析樣品的效率較低（一般而言，對一個樣品同時進(jìn)行定性定量分析約需2 h）。葉綠素含量測定是一種相對較快速簡單的測量技術(shù)，但傳統(tǒng)的測量方法多為現(xiàn)場抽濾后帶回實(shí)驗(yàn)室抽提，然后進(jìn)行分光光度計(jì)分析、熒光分光光度計(jì)分析或高效液相色普（HPLC）分析，但這種技術(shù)最快也需要1－2天才能獲得結(jié)果。這兩種方法均不能立即反映出水體中的藻類信息，而是要經(jīng)過一段分析時間，從而降低了生物監(jiān)測的時效性，大大影響有害藻華的監(jiān)測/預(yù)警。此外，葉綠素含量測定也可用原位傳感器進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，但這種方法多采用若丹明法（化學(xué)法）校正數(shù)據(jù)，誤差大，且傳感器需要經(jīng)常維護(hù)。衛(wèi)星遙感具備監(jiān)測范圍廣、數(shù)據(jù)多、不受地理位置和人為條件限制等優(yōu)點(diǎn)，但其容易受天氣條件影響，且往往需要藻類細(xì)胞累積到一定程度（可能已經(jīng)發(fā)生藻華）才能監(jiān)測到，往往達(dá)不到預(yù)警的效果，而且購買衛(wèi)星遙感數(shù)據(jù)費(fèi)用高，分析復(fù)雜，因此衛(wèi)星遙感多在專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行。
為配合國內(nèi)相關(guān)科研和監(jiān)測單位進(jìn)行有害藻華的快速現(xiàn)場監(jiān)測并進(jìn)行早期預(yù)警，澤泉生態(tài)開放實(shí)驗(yàn)室推出“有害藻華（HABs）監(jiān)測/預(yù)警的新解決方案”。
2 有害藻華（HABs）監(jiān)測/預(yù)警的新解決方案
2.1 監(jiān)測功能：
1） 利用浮游植物熒光儀PHYTO-PAM現(xiàn)場測量藍(lán)藻、綠藻、硅/甲藻的葉綠素a含量和總?cè)~綠素a含量，以及它們的光合活性（“生長潛能”）
2） 利用便攜式浮游植物流式細(xì)胞儀CytoSense或水下浮游植物流式細(xì)胞儀CytoSub對浮游植物細(xì)胞數(shù)進(jìn)行快速計(jì)數(shù)，并獲知主要類群的細(xì)胞濃度、細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)學(xué)信息；獲知微囊藻、棕囊藻等的群體（囊）動力學(xué)變化情況；對于鏈狀藻類，可以測量每條鏈的細(xì)胞數(shù)；對于硅藻、甲藻等形狀特殊的藻類，可根據(jù)浮游植物專家?guī)扈b定到種
3） 利用在線監(jiān)測型浮游植物流式細(xì)胞儀CytoBuoy對水體中的浮游植物進(jìn)行長期連續(xù)監(jiān)測
2.2 預(yù)警功能：
1） 根據(jù)葉綠素a含量和細(xì)胞數(shù)變化趨勢進(jìn)行預(yù)警
2） 浮游植物的光合活性（“生長潛能”）預(yù)示著未來的生長潛力，光合活性高、耐強(qiáng)光的浮游植物在環(huán)境條件（營養(yǎng)鹽、光照、溫度）適合時更容易發(fā)生藻華，
3） 微囊藻、棕囊藻等帶囊的藻類，不形成囊不發(fā)生藻華，而利用CytoSense等可長期監(jiān)測水體中微囊藻、棕囊藻等“囊”的變化，進(jìn)行早期預(yù)警
2.3 所需設(shè)備及用途：
1） 浮游植物熒光儀PHYTO-PAM
* 現(xiàn)場快速對水樣中的藍(lán)藻、綠藻、硅/甲藻自動定性（分類）定量（測葉綠素a）
* 現(xiàn)場快速測量藍(lán)藻、綠藻、硅/甲藻的光合活性（“生長潛能”）
2） CytoBuoy系列浮游植物流式細(xì)胞儀（CytoSense、CytoBuoy、CytoSub）
* 現(xiàn)場快速計(jì)數(shù)水體中浮游植物細(xì)胞總數(shù)
* 現(xiàn)場快速獲取浮游植物細(xì)胞類群信息（濃度、大小、類群、定種）
* 現(xiàn)場快速測量微囊藻、棕囊藻等細(xì)胞數(shù)以及“囊”的比例
3 浮游植物熒光儀技術(shù)原理及儀器介紹
3.1 利用葉綠素?zé)晒鉁y量葉綠素a含量的原理
浮游植物細(xì)胞中的葉綠素分子吸收的光能，一部分用于進(jìn)行光合作用，一部分以熱的形式耗散到環(huán)境中，剩余的部分以熒光的形式發(fā)射出來；铙w葉綠素?zé)晒獾膹?qiáng)度與細(xì)胞吸收的光強(qiáng)有關(guān)，但在很弱的光強(qiáng)下，葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度只與葉綠素含量的高低有關(guān)。因此可通過測量特定光強(qiáng)下（儀器控制）浮游植物細(xì)胞發(fā)出的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度來測量葉綠素a含量。
3.2 利用PHYTO-PAM對浮游植物分類的原理
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藍(lán)藻、綠藻、硅藻/甲藻往往是水體中的優(yōu)勢種。藍(lán)藻的主要捕光色素是藻膽蛋白，偏好吸收橙紅色光（645 nm）；綠藻的主要捕光色素是葉綠素a和b，偏好吸收藍(lán)光（470 nm）和紅光（665 nm）；硅藻和甲藻的色素相同，都是類胡蘿卜素和葉綠素c，偏好吸收綠光（520 nm）。PHYTO-PAM利用藍(lán)色（470 nm）、綠色（520 nm）、淺紅色（645 nm）和深紅色（665 nm）的發(fā)光二極管（LED）給出微秒級的測量光脈沖。不同顏色的測量光脈沖在高頻率下交替應(yīng)用，就可以獲得4種波長的光激發(fā)出的半同步的熒光信號。結(jié)合純種藻類的參考光譜（Reference spectrum）就可對藍(lán)藻、綠藻、硅/甲藻進(jìn)行分類（定性），進(jìn)而分別測量它們的葉綠素a含量和光合活性。由于硅藻和甲藻的色素組成差別不大，目前技術(shù)上還很難對它們進(jìn)行區(qū)分。
3.3 利用PHYTO-PAM測量光合作用的原理
如 3.1所述，（活體細(xì)胞中）葉綠素吸收的光分三條通路：光合作用（P）、熱耗散（D）和熒光（F）。根據(jù)能量守恒，P＋D＋F＝1。PHYTO-PAM可以直接檢測熒光強(qiáng)度，還可提供一個超強(qiáng)飽和閃光（1 s內(nèi)）使光合作用暫時被抑制，由此可知熱耗散的量，進(jìn)一步可知光合作用活性。這項(xiàng)技術(shù)已成為目前最方便、快捷的檢測植物光合作用的方法，其發(fā)明人 Schreiber教授因此獲得首屆國際光合作用協(xié)會創(chuàng)新大獎。
PHYTO-PAM可以測量的光合作用參數(shù)包括：
* Fv/Fm，浮游植物的潛在最大光合效率（“生長潛能”）
* Y，給定光強(qiáng)下浮游植物的實(shí)際光合效率
* ETR，給定光強(qiáng)下浮游植物的實(shí)際光合速率
* ETRmax，浮游植物的潛在最大光合速率
* a，浮游植物對光強(qiáng)的利用能力
* Ik，浮游植物耐受強(qiáng)光的能力
* 快速光曲線，結(jié)合水體光場可用于計(jì)算水體初級生產(chǎn)力
3.4 利用浮游植物光合活性進(jìn)行水華預(yù)警的原理
藻類的生長靠光合作用，藻華的爆發(fā)是在特定的環(huán)境條件下（富營養(yǎng)、高光、高溫）由藻類短期快速暴增造成的，這其間藻類必須具備極強(qiáng)的光合作用才能快速生長。監(jiān)測葉綠素a含量可以了解目前水體中的藻類生物量，但這只代表歷史（如果營養(yǎng)鹽很低，即使當(dāng)前藻類生物量高，也不具備發(fā)生藻華的可能）；而監(jiān)測藻類的光合作用活性可以了解藻類的“生長潛能”，結(jié)合其它環(huán)境條件可以預(yù)測未來（富營養(yǎng)條件且高光高溫下，即使當(dāng)前藻類生物量不高，但只要光合作用活性強(qiáng)，就具有極大的發(fā)生藻華的可能）。由于PHYTO-PAM可以測量自然水樣中藍(lán)藻、綠藻和硅/甲藻各自的光合作用，就可以對藻華發(fā)生時不同藻類類群進(jìn)行分析。利用PHYTO-PAM測量不同藻類葉綠素a含量和光合作用活性的功能，可以長期監(jiān)測自然水體中浮游植物種群生物量的動力學(xué)變化和不同類群光合作用潛力的變化趨勢，這對于藻華的預(yù)警具有重要參考價值。
3.5 浮游植物熒光儀PHYTO-PAM的主要功能
?* 全世界第一臺可對浮游植物自動分類的調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x
?* 可對藍(lán)藻、綠藻和硅/甲藻自動分類（定性）
?* 可自動測量水樣中藍(lán)藻、綠藻和硅/甲藻的葉綠素a含量和總?cè)~綠素a含量（定量）
?* 可同時測量水樣中藍(lán)藻、綠藻和硅/甲藻的光合作用活性
?* 可測量光合作用的光合效率和電子傳遞速率
?* 可自動記錄光合效率和電子傳遞速率的快速光響應(yīng)曲線
?* 用戶可做自己的參考光譜
?* 專業(yè)PhytoWin操作軟件，數(shù)據(jù)收集、分析和存貯功能強(qiáng)大
?* 用戶可利用培養(yǎng)的微藻做參考光譜，非“黑匣子”
?* 可在野外測量后根據(jù)水體藻類組成利用優(yōu)勢種（一種或多種）的參考光譜校對實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4 浮游植物流式細(xì)胞儀技術(shù)原理及儀器介紹
4.1 利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行浮游植物細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理
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流式細(xì)胞儀的基本原理：根據(jù)流體動力學(xué)原理讓液體中的顆粒（包括細(xì)胞）逐一通過激光束（檢測區(qū)），激光照射到顆粒上會引起光的散射，如果顆粒（如藻細(xì)胞）含有色素還可以發(fā)出熒光，這些散射光和熒光被檢測器收集后轉(zhuǎn)換成電信號存儲下來，并利用軟件進(jìn)行自動分析。水中的浮游植物細(xì)胞做為一個個顆粒，當(dāng)然可以進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。
一臺功能強(qiáng)大的流式細(xì)胞儀可以檢測浮游植物細(xì)胞的前向光散射（FWC）、側(cè)向光散射（SWC）和多色熒光。這些信號除了用于進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)外，還包含如下信息：前向光散射反映了細(xì)胞的大；側(cè)向光散射反映了細(xì)胞的形狀；多色熒光則反映了細(xì)胞含有哪些色素。這些信息結(jié)合起來可以對不同類型的細(xì)胞進(jìn)行聚類（聚群）分析。
4.2 傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行浮游植物細(xì)胞計(jì)數(shù)的缺陷
傳統(tǒng)的商用流式細(xì)胞儀都是為生物醫(yī)學(xué)研究設(shè)計(jì)的，用于免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域，盡管也有人用于浮游植物研究，但由于以下缺點(diǎn)難以進(jìn)行有害藻華監(jiān)測和預(yù)警：
* 儀器沉重、無法在野外使用
* 每次測量需要復(fù)雜的校準(zhǔn)，每次開機(jī)需要校準(zhǔn)，儀器移動后需要校準(zhǔn)
* 必須專人管理，使用人員必須經(jīng)過長期培訓(xùn)
* 測量粒徑范圍小，一般為0.4微米至幾十個微米，多數(shù)浮游植物細(xì)胞超過了其監(jiān)測范圍
* 測量濃度范圍小，一般為105－106個細(xì)胞/升，樣品過濃需要稀釋，樣品過稀需要濃縮
* 樣品必須經(jīng)過嚴(yán)格的預(yù)處理（過濾、分級等）才可測量
* 無法直接測量微囊藻、棕囊藻等群體樣品，需要預(yù)先打碎群體
* 需要外加鞘液，用量大
* 維護(hù)成本高
4.3 浮游植物流式細(xì)胞儀的主要特性
CytoBuoy系列浮游植物流式細(xì)胞儀是專為浮游植物研究設(shè)計(jì)的流式細(xì)胞儀，適用于野外現(xiàn)場測量，充分考慮到了藻類樣品的復(fù)雜性和儀器的便攜性、抗震性。
* 全球唯一專為浮游植物研究設(shè)計(jì)的流式細(xì)胞儀
* 儀器便攜、防震、防抖、耐沖擊、防水或防濺水
* 操作簡單，不需復(fù)雜的校準(zhǔn)，不需專人管理
* 測量粒徑范圍大，覆蓋幾乎所有的浮游植物粒徑范圍：1－4000 mm（標(biāo)準(zhǔn)版）或0.4－4000 mm（pico-版）
* 測量濃度范圍大，達(dá)102－1010個細(xì)胞/升
* 樣品不需預(yù)處理即可直接測量
* 利用GV模塊可直接測量帶氣囊的藻（微囊藻、棕囊藻）
* 不需外加鞘液，利用樣品過濾液做為循環(huán)鞘液
* 可獲取每個細(xì)胞所有檢測信號的掃描圖譜，每個圖譜可獲得9個拓?fù)鋵W(xué)指標(biāo)，內(nèi)含豐富的形態(tài)學(xué)信息
* 可建立浮游植物專家?guī)，對硅藻、甲藻等形態(tài)特殊的種類鑒定到種
* 可升級增加成像功能，拍攝特定細(xì)胞的照片
4.4 浮游植物流式細(xì)胞儀的應(yīng)用模式
CytoBuoy系列浮游植物流式細(xì)胞儀有三種型號：
* 便攜式浮游植物流式細(xì)胞儀CytoSense
* 在線監(jiān)測型浮游植物流式細(xì)胞儀CytoBuoy
* 水下浮游植物流式細(xì)胞儀CytoSub
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CytoSense屬于便攜式儀器，可在室內(nèi)、野外、船上（包括小艇）使用。
CytoBuoy用于定點(diǎn)長期監(jiān)測，數(shù)據(jù)可遠(yuǎn)程無線傳輸。
CytoSub可用于水下剖面測量或AUV搭載巡航測量，可自容式測量，可在線測量。
根據(jù)需要，CytoSense可升級為CytoBuoy或CytoSub。
4.5 浮游植物流式細(xì)胞儀測量微囊藻的方法
有些浮游植物（如微囊藻）帶有氣囊。氣囊會改變光散射，從而會改變這類浮游植物的“光學(xué)指紋”。通過GV模塊施加瞬間高壓可以打破氣囊，從而消除由于氣囊引起的光散射變化，修復(fù)“光學(xué)指紋”。通過兩次測量可以方便的區(qū)分出帶氣囊的種：第一次直接測量，第二次施加高壓破壞氣囊后測量。那些在施加高壓后改變了光散射的種就是帶氣囊的種。
微囊藻、棕囊藻等帶囊的藻類，不形成囊不發(fā)生藻華，而利用CytoSense等可長期監(jiān)測水體中微囊藻、棕囊藻等“囊”的變化，進(jìn)行早期預(yù)警。
4.6 浮游植物流式細(xì)胞儀鑒定到種的方法
當(dāng)細(xì)胞顆粒在流動池中通過檢測區(qū)域時，CytoBuoy系列流式細(xì)胞儀可以掃描記錄各種光學(xué)信號（散射、熒光）的動態(tài)變化（掃描圖譜，全球唯一），這些信號包涵了豐富的細(xì)胞形態(tài)學(xué)信息，利用這些形態(tài)學(xué)信息可以建立浮游植物特征信息專家數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而利用CytoBuoy進(jìn)行浮游植物的詳細(xì)分類，有助于了解浮游植物的種群變化和水華預(yù)警。
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每個細(xì)胞的掃描圖譜包含了豐富的形態(tài)學(xué)信息
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這些形態(tài)學(xué)信息可用于建立浮游植物專家?guī)?/p>
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軟件根據(jù)掃描圖譜，可以獲知鏈狀細(xì)胞的具體細(xì)胞數(shù)目
4.7 浮游植物流式細(xì)胞儀應(yīng)用于高濁度水體的對策
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1）進(jìn)樣篩選
水樣被進(jìn)樣器采集后，在進(jìn)樣器內(nèi)部經(jīng)過篩選排除空氣和砂粒。進(jìn)樣器內(nèi)部設(shè)計(jì)獨(dú)特，從上到下有三個出水口，其中上邊的出水口用于排除空氣，而多數(shù)砂粒由于沉降速率較大會經(jīng)下部出水口排除，只有中間的出水口用于采集浮游植物、浮游動物和與它們密度相差不大的砂粒進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和其它分析。如果水中砂粒粒徑很大，可以在進(jìn)樣器中增加一個不銹鋼篩網(wǎng)，用于濾除粒徑大于1 mm的泥沙顆粒。對于多數(shù)粒徑大于50-100 mm的砂粒而言，它們的沉降速率大于CytoSense的進(jìn)樣流速（1-2 cm/s），因此不會被進(jìn)樣器吸入。
2）外置鞘液系統(tǒng)
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5 有害藻華監(jiān)測/預(yù)警展望
綜上所述，浮游植物熒光儀PHYTO-PAM和CytoBuoy系列浮游植物流式細(xì)胞儀在有害藻華的監(jiān)測/預(yù)警方面具有非常大的應(yīng)用潛力，前者重在自動分類的基礎(chǔ)上同時了解生物量和光合活性（“生長潛能”），后者重在專門針對浮游植物的細(xì)胞計(jì)數(shù)，且可直接測量微囊藻，對形狀特殊的藻可鑒定到種。兩種技術(shù)都是目前國際上最前沿的技術(shù)，且儀器都是為野外應(yīng)用而設(shè)計(jì)，充分考慮到了現(xiàn)場監(jiān)測的困難。兩種技術(shù)可分別用于有害藻華的監(jiān)測/預(yù)警，如果結(jié)合使用，對于監(jiān)測/預(yù)警的效果會更好。相信兩種技術(shù)對于我們淡水與海洋環(huán)境的有害藻華監(jiān)測/預(yù)警都會發(fā)揮極大的助力作用。
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