摘要：本文以對硝基苯胺為目標(biāo)污染物，通過富集培養(yǎng)某化工廠好氧處理池的污泥，獲得了對該污染物降解效果較好的混合培養(yǎng)微生物。用該微生物作為降解菌源，對對硝基苯胺的生物降解特性進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。

1.前言

硝基苯胺（NA）的三種異構(gòu)體：鄰硝基苯胺、間硝基苯胺、對硝基苯胺，是印染、橡膠、制藥、塑料和油漆等行業(yè)的重要原料，是染料工業(yè)的中間體。這3種化合物可通過呼吸道、消化道而攝入體內(nèi),使氧和血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白，影響組織細(xì)胞供氧而造成內(nèi)窒息，且被認(rèn)為對人體有很強(qiáng)的致癌性。苯胺類化合物對環(huán)境的污染一直被人們所關(guān)注，我國把苯胺類化合物列入環(huán)境中的重點(diǎn)污染物，并制定最高容許排放濃度5mg/L。此類化工廢水治理較為困難，國內(nèi)研究較少，至今為止絕大多數(shù)采用物理、化學(xué)的方法加以處理，但這些方法處理費(fèi)用偏高，操作要求較為嚴(yán)格，實(shí)際上難以推廣運(yùn)用。因而迫切需要尋找一些行之有效的、費(fèi)用相對低廉的處理方法。本文以對硝基苯胺為目標(biāo)污染物，通過富集培養(yǎng)某化工廠好氧處理池的污泥，獲得了對該污染物降解效果較好的混合培養(yǎng)微生物。用該微生物作為降解菌源，對對硝基苯胺的生物降解特性進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。

2.實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1菌種來源

菌種來自某化工廠廢水處理系統(tǒng)好氧池污泥

2.2試驗(yàn)儀器及設(shè)備

恒溫?fù)u床；7500分光光度計；Ph計；高速離心機(jī)

2.3培養(yǎng)液及微量元素

降解菌培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O,430mg/L；KH2PO4·7H2O,170mg/L；MgSO4·7H2O,22.5mg/L；CaCl2,27.5mg/L；NaEDTA,100mg/L；Na2HPO4·7H2O,668mg/L。
基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO4,1000mg/L；Na2HPO4·12H2O,7000mg/L；檸檬酸鐵，40mg/L；CaCl2·2H2O，100mg/L；MgSO4·7H2O,300mg/L；PH，7.35。
YPS培養(yǎng)液：酵母粉10g/L；蛋白胨10g/L；氯化鈉5g/L。
微量元素（TMS）：FeCl3·6H2O；ZnCl2·4H2O；CoCl2·2H2O；Na2MoO4·2H2O；CaCl2·2H2O；CuSO4·5H2O；H3BO4；HCl等。
基礎(chǔ)無機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液：每1L無機(jī)培養(yǎng)液中添加3mL微量元素和1g無菌酵母粉。

2.4研究內(nèi)容與方法

2.4.1降解菌的分離

2.4.1.1富集培養(yǎng)

菌種馴化過程在30℃的恒溫室中進(jìn)行。首先取5mL新鮮的活性污泥加入到盛有50mLYPS培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，在120r/min轉(zhuǎn)速下，連續(xù)振蕩培養(yǎng)24h，然后從中取10%培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的YPS培養(yǎng)液中。在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，從中取5mL作為接種菌液，加入到含20mg/L對硝基苯胺的基礎(chǔ)無機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液中，10天左右培養(yǎng)液原黃顏色褪去。再取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的含對硝基苯胺基礎(chǔ)無機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液中，兩天后培養(yǎng)液黃顏色也褪去。把此種培養(yǎng)液作為降解試驗(yàn)的接種菌液，菌體的OD值大約1.2左右，降解特性試驗(yàn)中菌體的接種量均為10mL。

2.4.1.2純培養(yǎng)

從降解速率較高的富集培養(yǎng)物中取樣，在含有對硝基苯胺平板上劃線分離，放置于30℃恒溫室內(nèi)培養(yǎng)數(shù)天，觀察菌落生長情況，把形成的耐受力強(qiáng)單菌落挑斜面保存（即為純培養(yǎng)物）。

2.4.2對硝基苯胺降解特性試驗(yàn)

pH值：對硝基苯胺初始濃度約為50mg/L，調(diào)節(jié)混合培養(yǎng)液初始pH值，置于30℃恒溫室振蕩培養(yǎng)36h后，以初始培養(yǎng)液為空白參比測定OD值以及對硝基苯胺去除率，確定混合培養(yǎng)微生物生長適宜的pH值范圍。
外加碳源：對硝基苯胺初始濃度約為50mg/L、100mg/L，pH值約為7.5，分別添加0g/L、0.5g/L、1.0g/L葡萄糖條件下，探明微生物能否利用對硝基苯胺作為生長的唯一碳源、氮源和能源，以及不同葡萄糖量對微生物生長及對硝基苯胺去除率的影響。
基質(zhì)濃度：對硝基苯胺初始濃度約為50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，pH值約為7.5，間隔一定時間取樣，測定培養(yǎng)液中對硝基苯胺濃度、pH及OD值的變化。通過微生物的生長曲線、基質(zhì)降解曲線等過程來分析該混合培養(yǎng)微生物的基本特性。

2.5分析項(xiàng)目和測定方法

對硝基苯胺濃度：采用分光光度法，在最大吸收峰（λmax=360nm）測定其吸光度?；旌弦航?jīng)9000r/min高速離心5min，取上清液測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其濃度。若對硝基苯胺濃度超過10mg/L均稀釋后測定。
菌體濃度OD值：采用分光光度法，混合液充分搖勻后直接在波長λ=600nm測定其吸光度。溶液的菌體濃度等于實(shí)際測定的OD值減去空白值（不接菌液）的OD值。
pH值：混合液充分搖勻后直接用pH計測定。

3.結(jié)果與討論

3.1pH值對降解的影響

混合培養(yǎng)微生物對硝基苯胺初始濃度約為50mg/L，在不同初始pH值條件下，經(jīng)30℃恒溫振蕩培養(yǎng)36h后，其菌體濃度OD值和對硝基苯胺去除率關(guān)系。從圖中可以看出微生物生長適應(yīng)pH值范圍較寬，在初始pH值為6.5～8.5條件下生長均較好。這與AdrianSaupe、Zeyer、Lauzening等國外研究者的研究結(jié)果相吻合——能降解硝基苯類化合物的Pseudomonassp.、Comamonastestosteroni、Bacillussp.、Acidovoraxdelafiedii菌屬最適pH值為6.5～8.5，可以說pH值也是影響降解速率的重要因子。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)微生物初始pH值為3.2、3.7時，其菌體OD值均小于0.4，去除率也很低；pH值為3.7時去除率為19.5%，而pH值為3.2時幾乎未見有降解。這說明該混合培養(yǎng)微生物中對硝基苯胺降解菌不適宜在較低的pH值下生長，但仍具有一定的耐酸性。

值得注意是，當(dāng)初始pH值大于8.5，甚至達(dá)到10.2時，混合液OD值還是比較高，均超過1.2，但對硝基苯胺去除率幾乎為零。這是由于混合液中添加了1.0g/L葡萄糖和1.0g/L酵母膏的緣故。葡萄糖作為外加碳源，提供了微生物生長的電子受體，促進(jìn)了非對硝基苯胺降解菌的生長。

3.2不同碳量對降解的影響

混合微生物能利用對硝基苯胺作為生長的唯一氮源，適量的外在碳源對微生物的生長有很大的促進(jìn)作用，混合液的菌體濃度隨外在碳源（葡萄糖）添加量的增加而增大。但混合液中不添加葡萄糖時，即對硝基苯胺作為微生物生長的唯一碳源、氮源和能源，菌體濃度明顯小于添加外在碳源的混合液，最終OD值只有0.05。
葡萄糖添加量對對硝基苯胺去除率也有影響。當(dāng)?shù)孜飳ο趸桨窛舛葹?1mg/L時，不添加外在碳源，96小時內(nèi)去除率為34.7%。而添加0.5g/L葡萄糖外在碳源，前24h對硝基苯胺降解速率要快于添加1.0g/L葡萄糖的培養(yǎng)液，24h之后其降解速率要慢于后者，但最終去除率都能達(dá)到97％左右。從圖4可以看出，當(dāng)?shù)孜飳ο趸桨窛舛葹?3mg/L左右時，葡萄糖的添加量越多，對硝基苯胺的降解速率越快，在24h之后表現(xiàn)的更為明顯，最終的去除率分別為16.8％、72.2％和96.8％。
從以上的分析可以說明對硝基苯胺作為難降解有機(jī)物，并不是混合微生物新陳代謝理想的碳源。有研究表明，此種難降解化合物在被降解之前，往往需要利用一些簡單的碳源。混合微生物利用初級碳源（葡萄糖）生長，并產(chǎn)生相應(yīng)的誘導(dǎo)酶，從而使對硝基苯胺得到降解。

3.3不同底物濃度對降解的影響

前12小時內(nèi)4種培養(yǎng)液菌體生長均達(dá)到對數(shù)增長期，菌體個數(shù)成對數(shù)增長，但此時對硝基苯胺濃度并未急劇下降。這是由于培養(yǎng)液中添加了1.0g/L葡萄糖和1.0g/L酵母粉,在初始階段微生物以葡萄糖和酵母粉中的碳作為初級碳源，而且酵母粉中含有維生素B2，促進(jìn)了微生物的生長。對硝基苯胺去除率隨底物濃度的增加而下降。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時（43.03mg/L），對硝基苯胺降解速率明顯要高于其它底物濃度較高的培養(yǎng)液。然而當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭龋?3.03mg/L）后，基于高濃度有機(jī)物毒性對酶的抑制作用，降解速率比較緩慢，降解速率也比較相近。

3.4混合培養(yǎng)與純培養(yǎng)對硝基苯胺降解效率的比較

混合培養(yǎng)對硝基苯胺的去除率要明顯高于純培養(yǎng)。純培養(yǎng)對硝基苯胺的最高去除率只有0.07左右，比混合培養(yǎng)97％的去除率要小很多。有研究表明聚乙烯醇（PVA）的生物降解需要混合菌完成，一般是pseudomonassp.和Alealigenessp.或兩株不同的pseudomonassp.，它們之間靠一種共生關(guān)系來完成PVA的降解。Murray[10]對Bacteroidescellulosolvens和Clostridiumsaccharolyticum混合培養(yǎng)分解纖維素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，前者分解纖維素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，前者分解纖維素為后者提供生長所需碳源，后者又可利用前者產(chǎn)生的有毒中間產(chǎn)物，消除對前者分解纖維素的反饋抑制。Mori[11]認(rèn)為，ClostridiumThermohydrosulfuriumYM3和C.ThermocellumYM4混合培養(yǎng)降解纖維素效果明顯高于單菌培養(yǎng)，主要原因是兩菌互相提供了對方所需的生長因子。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也可以證明，混合菌對有機(jī)物的去除率要高于單一菌株，但混合菌株之間是以何種關(guān)系促成有機(jī)物的降解有待于進(jìn)一步研究。

3.5對硝基苯胺降解的動力學(xué)分析

從上述3.2的分析中可以看到，適量的外在碳源可以大大提高對硝基苯胺的去除率。為了解混合培養(yǎng)微生物降解對硝基苯胺的動力學(xué)性質(zhì)，先假設(shè)對硝基苯胺降解遵循一級反應(yīng)動力學(xué)。根據(jù)一級反應(yīng)動力學(xué)公式，對試驗(yàn)數(shù)值進(jìn)行整理，分別做曲線，并擬合求解反應(yīng)速率常數(shù)K，見表1。

從相關(guān)系數(shù)可以看出，混合培養(yǎng)微生物降解對硝基苯胺反應(yīng)可以近似用一級反應(yīng)來描述。另外，從降解速率常數(shù)K值的大小可以進(jìn)一步說明補(bǔ)充碳源對不同底物濃度以及碳源量在降解對硝基苯胺過程中的作用是不一樣的。在低底物濃度（41mg/LNA），補(bǔ)充0.5g/L葡萄糖可以大大提高對對硝基苯胺的降解作用，但過多的外加碳源量（1.0g/LGlu）反而降低了對硝基苯胺的降解速率。這是由于過多的葡萄糖對對硝基苯胺的降解起到競爭性抑制作用。在高底物濃度（83mg/LNA），隨著外加碳源量的增加，對硝基苯胺的降解速率也相應(yīng)的增加，但降解速率要慢于低底物濃度的培養(yǎng)液。

表1對硝基苯胺在不同濃度下的降解速率常數(shù)
Table1ThedegradationratecontantatdifferentinitialconcentrationofNA
項(xiàng)目41mg/LNA83mg/LNA
0g/LGlu0.5g/LGlu1g/LGlu0g/LGlu0.5g/LGlu1g/LGlu
K×103/L(g·h)-1相關(guān)系數(shù)3.50.8601480.912141.40.9071.50.85713.50.985635.50.9082

4.結(jié)論

通過富集培養(yǎng)某化工廠的活性污泥獲得降解對硝基苯胺的混合培養(yǎng)微生物。在好氧條件下對硝基苯胺具有較高的降解速率4.1mg/（L·h）。降解反應(yīng)遵循一級反應(yīng)動力學(xué)。實(shí)驗(yàn)確定了該混合培養(yǎng)物的適宜生長條件：pH為6.5～8.5，溫度為30℃左右。該混合培養(yǎng)物能利用對硝基苯胺作為生長的唯一碳源、氮源、能源，但降解速率較慢。適量的外加碳源可以大大的提高對硝基苯胺的降解速率，但在低底物濃度時過多的碳量會對對硝基苯胺的降解起到競爭性抑制作用?；旌吓囵B(yǎng)微生物的降解速率要明顯的高于純培養(yǎng)的單一菌種，因此尋找高效好氧降解菌，仍是今后研究的一個重點(diǎn)。

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