羥自由基（•OH）是一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷,使細(xì)胞壞死或突變。因此，•OH參與的各種研究已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域中的重要研究課題。但由于•OH的反應(yīng)活性大，壽命短，存在濃度低，給有關(guān)的研究和測(cè)定造成一定難度。目前，通常采用如下方式：電子自旋共振法（ESR）[1]、高效液相色譜法（HPLC）[2]、化學(xué)發(fā)光法[3]、熒光法[4]、分光光度法[5，6]。這些方法中大多數(shù)都采用•OH捕捉劑與其結(jié)合生成相對(duì)穩(wěn)定的自由基，用新生成的自由基特性來間接測(cè)定•OH的表觀生成率。

二甲亞砜（DMSO）為無色透明液體（或結(jié)晶），是一種既溶于水又溶于有機(jī)溶劑的極為重要的非質(zhì)子極性溶劑。吸濕性強(qiáng)，無腐蝕、無毒。性質(zhì)穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間在沸點(diǎn)溫度下加熱，微量分解；在堿性狀態(tài)下可抑制腐蝕或分解。能參與氧化、還原、鹵化、脫羧、絡(luò)合等化學(xué)反應(yīng)，并能起到加速的作用。由于其優(yōu)良的性能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、石油、化工、有機(jī)合成、電子、涂料、冶金、染料和高分子材料等許多化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域。

近年來，國內(nèi)外均有報(bào)道，利用DMSO捕集•OH，定量測(cè)定•OH的產(chǎn)率。筆者結(jié)合國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)DMSO在•OH檢測(cè)中的應(yīng)用作介紹，從而為•OH的進(jìn)一步研究提供參考。

1 采用DMSO捕集•OH的測(cè)定方法

1.1   HPLC

HPLC是一種高效、快速的分離技術(shù)，它具有高壓、高速、高效和高靈敏度的特點(diǎn)，只需要微升數(shù)量級(jí)的樣品就可以進(jìn)行全面分析，檢測(cè)器最小檢測(cè)量可達(dá)10-9～1011 g[7]。測(cè)定過程中必須先選擇合適的化合物捕集被測(cè)體系中的•OH，使之生成具有一定穩(wěn)定性，且能被液相色譜分離與檢測(cè)的產(chǎn)物，然后用HPLC進(jìn)行測(cè)定。
近幾年，DMSO常用來作為捕捉劑，定量測(cè)定•OH 的產(chǎn)率。首先使DMSO與•OH反應(yīng)生成甲基亞磺酸(CH3SOOH)和甲基自由基,然后用重氮鹽與甲基亞磺酸反應(yīng),生成的重氮化合物利用HPLC測(cè)定。其測(cè)定原理為：

Fe2++H2O2→Fe3++OH-+OH•                        （1）

CH3SOCH3+OH•→CH3SOOH+CH3•                     （2）
O
‖
CH3SOOH+Ar－N=N+→Ar－N=N—S—C3+H+            （3）
‖ 
O
用堅(jiān)牢黃GC鹽與通過二甲基亞砜捕捉•OH后生成的甲基亞磺酸反應(yīng)，將生成的鄰-氯苯重氮甲基砜用乙酸乙酯萃取，然后用HPLC定量地測(cè)定了Fenton反應(yīng)體系中產(chǎn)生的•OH。以Capcell-Pak NH2為流動(dòng)柱，乙醇與正己烷混合液(3∶100，體積比)為流動(dòng)相分離，流速為1 mL/min；檢測(cè)器為Shimadzu SPD-10AV紫外－可見分光光度計(jì)，C-R6A積分議；檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm；進(jìn)樣：20 μL/次。RAO等[8]等用DMSO作捕捉劑，在甲硫氨酸或催化酶的作用下，與•OH作用生成甲基亞磺酸。使用Radical-Pak C18柱，以5%甲醇為流動(dòng)相(流速2 mL/min)進(jìn)行分離，在214、240 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，檢測(cè)限為50 ng •OOH和200 ng •OH。GAMOH等[9]用DMSO捕獲•OH生成甲基亞磺酸，再同堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽反應(yīng)生成偶氮砜。在40 ℃，STR-ODSⅡ柱，80%乙腈作流動(dòng)相分離，420 nm檢測(cè)，線性范圍達(dá)到0.01 mol/L。比較了幾種重氮鹽與甲基亞磺酸的反應(yīng)產(chǎn)物通過HPLC的測(cè)定結(jié)果（見表1）。相比較而言，堅(jiān)牢黃GC鹽與甲基亞磺酸反應(yīng)產(chǎn)物的信號(hào)不但出現(xiàn)尖銳的單峰，且峰高不受Fe2+等離子的影響[10]。

表1  幾種重氮鹽與甲基亞磺酸的反應(yīng)產(chǎn)物通過HPLC的測(cè)定結(jié)果

1.2  熒光法

某些物質(zhì)的分子能吸收能量而發(fā)射出熒光，根據(jù)熒光的光譜和熒光強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的方法，稱為熒光分析法。該法具有靈敏度高，選擇性強(qiáng)，需樣量少和方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。它的測(cè)定下限通常比光度法低2～4個(gè)數(shù)量級(jí)，應(yīng)用非常廣泛。近年來，DMSO作為•OH的探針試劑引起了人們的關(guān)注。楊小峰等[11]使•OH先與DMSO反應(yīng), 定量生成甲基自由基, 然后甲基自由基被自旋標(biāo)記熒光探針I(yè)捕捉, 形成強(qiáng)熒光產(chǎn)物, 熒光強(qiáng)度的增量（ΔF）與反應(yīng)生成的甲基自由基的量成正比，也與參加反應(yīng)的•OH的量成正比�；谏鲜鲈斫⒌谋碚�•OH的實(shí)驗(yàn)方法，具有操作簡(jiǎn)單、專一性好、靈敏度較高和易于推廣等特點(diǎn)，可用于化學(xué)與生物體系中•OH 的表征。谷學(xué)新等[12]采用Fenton體系產(chǎn)生•OH與DMSO反應(yīng)產(chǎn)生甲醛，然后與乙酰丙酮、氨發(fā)生Hantzsch反應(yīng)生成的3，5-二乙酰-1，4-二氫吡啶，其最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為419.4、505.5 nm，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化可以間接定量羥基自由基的產(chǎn)生量。TAI等[13]利用DMSO和•OH反應(yīng)生成定量的甲醛這一反應(yīng)，再用氨和1，3-環(huán)己二烯聚酯在pH為4.5的條件下和甲醛反應(yīng)，產(chǎn)生熒光吸收在400.4、452.3 nm的物質(zhì)，通過測(cè)定熒光的大小，即可判斷羥基自由基的量。

1.3  比色法

比色法作為一種定量分析的方法，最早開始于19世紀(jì)30～40年代，是以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測(cè)組分含量的方法。該法簡(jiǎn)便實(shí)用，費(fèi)用低廉，操作簡(jiǎn)單，易為一般實(shí)驗(yàn)室所用。宋艷等[14]采用Fenton體系產(chǎn)生•OH與DMSO反應(yīng)產(chǎn)生甲醛，再與2，4-二硝基苯肼(DNPH)反應(yīng)生成穩(wěn)定的酒紅色腙類物質(zhì)(HCHO-DNPH)，其最大吸收波長(zhǎng)為390 nm，光度法測(cè)定其含量可間接測(cè)定•OH的生成量。徐向榮等[15]利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的•OH與DMSO反應(yīng)，生成甲基亞磺酸，再與堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽反應(yīng)生成偶氮砜，比色法測(cè)定其含量可間接測(cè)定OH•的生成量。

1.4  其他方法

DMSO常被用作•OH的捕獲劑，其優(yōu)點(diǎn)是它對(duì)大部分的生物體系具有較高的容忍度以及對(duì)•OH有較好的靈敏度。TAKESHITA等[19]用DMSO來捕獲大鼠體內(nèi)通過X-射線產(chǎn)生的•OH，生成甲基自由基，再以PBN（苯基叔丁基氮氧化合物）捕獲甲基自由基，通過電子順磁共振（EPR）間接檢測(cè)•OH的含量，該結(jié)果為研究人類受輻射傷害的程度提供了一定的參考。楊青等[17]報(bào)道了Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的輕自由基氧化DMSO，生成的甲醛與乙酞乙酸乙酷和氨發(fā)生Hantzsch反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物3，5-二乙氧基碳基-2，6一二甲基-1，4一二氫吡啶在－1.09 V(SCE)處有一靈敏的二階導(dǎo)數(shù)極譜峰，通過峰電流變化可間接測(cè)定•OH。VULCANO等[18]研究表明，DMSO在捕捉生理產(chǎn)生的•OH時(shí)，對(duì)TNF-a的抑制作用相對(duì)較小，具有較好的捕捉效果。還可以將•OH與二甲基亞砜反應(yīng)產(chǎn)生甲烷，應(yīng)用氣相色譜儀檢測(cè)所生成的甲烷，判斷該反應(yīng)體系有無•OH生成以及測(cè)定•OH的相對(duì)含量。但是，氣相色譜法測(cè)定•OH存在專一性問題，而且靈敏度和重復(fù)性較差。

2  結(jié)語

隨著人們對(duì)環(huán)境問題的重視，高級(jí)氧化技術(shù)以其高效、快速、無二次污染等眾多優(yōu)點(diǎn)而成為環(huán)境污染治理的一個(gè)重要方法，而羥基自由基的定量、在線、準(zhǔn)確檢測(cè)是研究高級(jí)氧化反應(yīng)機(jī)制的重要手段與工具。DMSO由于其優(yōu)良的特性，常被用來作為•OH的捕捉劑，定量測(cè)定•OH產(chǎn)率。相信隨著該研究領(lǐng)域的進(jìn)一步深入，DMSO在•OH檢測(cè)中的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

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